Interação Molecular por Fluorescência e Ressonância Plasmônica de Superfície

 

Coordenadores:  Adriana K. Carmona e Aparecida S. Tanaka

Técnicos responsáveis: Ricardo J. S. Torquato e Thaysa Paschoalin

 

 I. Equipamentos Multiusuários (FAPESP/EMU-2010)

  1. SISTEMA DE MICROSCOPIA DE CAMPO CLARO E FLUORESCÊNCIA - FAPESP 2009/53840-0
  2. ESPECTROFOTÔMETRO DE FLUORESCÊNCIA F7000 - FAPESP 2009/53840-0
  3. SISTEMA DE RESSONÂNCIA PLASMONICA DE SUPERFÍCIE (BIACORE T200) - FAPESP 2009/53844-6

 

 

 1. SISTEMA DE MICROSCOPIA DE CAMPO CLARO E FLUORESCÊNCIA

 

Localização:

Edifício de Pesquisa II – UNIFESP

Rua Pedro de Toledo 100, 7o andar, São Paulo, SP.

 

Técnico responsável:

Thaysa Paschoalin

email: tpaschoalin@unifesp.br

telefone: 5576-4450 Ramal 1977

 

Descrição do sistema:

Fabricante: Carl ZeissMicroImaging

O sistema é composto por um Microscópio Invertido AxioObserver Z1 (Eixo motorizado) que possui um display touchscreen para visualização de todos os comandos do microscópio: campo claro, contraste de fases, DIC (contraste de interferência diferencial) e fluorescência DG4. O microscópio apresenta configuração para ensaios com preparações fixadas e cultura de células e está equipado com aparato de climatização para estudos celulares com controle da temperatura, CO2 e umidade. A platina motorizada (Maerzhaeuser) pode receber o suporte universal (lâminas e placas de petri), e também está disponível o adaptador (com aquecimento) para placa multiwell (24 poços). Com essa configuração é possível realizar ensaios de longa duração com células mantidas em cultura, com controle de temperatura e CO2. Os acessórios do sistema estão relacionados abaixo:

 

Objetivas:

PlanNeofluar 5x (0.16)

Plan Neofluar 10x (0.3)

LD Plan Neofluar 20X (0.4)

LD PlanNeofluar 40X (0.6)

C- Apochromática 40x (1.2)

PlanNeofluar 63X (1.25)

 

Filtros de fluorescência:

Jogo 20 (Rodamina)

Jogo 21 HE (fura-2)

Jogo 25 (DAPI/FITC/Texas Red)

Jogo 31 (Cy 3)

Jogo 38

Jogo 40 (AMCA/FITC/TRITC)

Jogo 49 (DAPI)

Jogo 77 (Cy5)

(obs: os filtros podem ser utilizados por uma grande variedade de indicadores, não apenas os mencionados acima. Consultar o site abaixo para detalhes dos espectros dos filtros).

https://www.micro-shop.zeiss.com/us/us_en/spektral.php?f=fi

 

Sistema de fluorescência de alta velocidade DG-4:

Switcher Lambda DG-4 – sistema de filtros (até 4) de interferência de iluminação para comutação do comprimento de onda rápido (tempo de comutação entre dois filtros ~1.2ms). Faixa externa 330-700nm (lâmpada Xenon XBO175). Mais informações consultar o site abaixo:

http://zeiss.magnet.fsu.edu/tutorials/sutterdg4/index.html

 

Software:

Axiovision 4.8 com módulos:

-  Fisiologia (Physiology)

-  Time lapse

-  Comander

-  Mark find e multichannel para fluorescência

 

Câmeras:

Alta resolução (13 megapixel/colorida) – AxiocamHRc

Alta velocidade (monocromática)– AxiocamHSm (64quadros/s).

  

 

 

 

 

 2. ESPECTROFOTÔMETRO DE FLUORESCÊNCIA F7000

 

Localização:

Edifício de Pesquisa II – UNIFESP

Rua Pedro de Toledo, 669, 7o andar, São Paulo, SP.

 

Técnico responsável:

Thaysa Paschoalin

email: tpaschoalin@unifesp.br

telefone: 5576-4450 Ramal 1977

 

Descrição do equipamento:

Fabricante: HITACHI – Ano 2011

O espectrofluorímetro de fluorescência HITACHI F-7000, permite a quantificação de alterações de fluorescência, fosforescência e luminescência em cubeta com agitação e aquecimento ou em placa de ELISA.

 

Características  do equipamento:

- Faixa de comprimento de onda: 200 – 750nm

- Faixa espectral: 1 / 2,5 / 5 / 10 / 20nm

- Exatidão de comprimento de onda: 1nm

- Faixa fotométrica: -9999 a 9999

- Veloc. de varredura: 30, 60, 240, 1200, 2400, 12000, 30000, 60000 nm/min

 

Acessórios:

  • Sistema de controle de temperatura Peltier com suporte de célula. Intervalo de temperatura (-10oC a 105oC). O sistema permite análises bioquímicas e celulares que dependem de controle rígido da variação de temperatura.
  • Software para medida de variação iônica (IntracellularCationmeasurement) – permite avaliar as modificações iônicas de pH , Ca2+, entre outros que são críticas para a identificação das respostas celulares à agonistas e a toxicidade de drogas.
  • Adaptador para leitura de placas multiwell (96 poços) – permite realizar ensaios de fluorescência em diferentes condições experimentais, favorecendo a rápida detecção dos efeitos de agonistas e drogas em varias concentrações.

  

 

 

 3. Sistema de ressonância plasmônica de superfície (Biacore T200)

 

Localização:

Edifício de Pesquisa II – UNIFESP

Rua Pedro de Toledo,669, 8o andar, São Paulo, SP.

 

Técnico responsável:

Ricardo J. S. Torquato

email: torquato.bioq@epm.br

telefone: 5576-4444 Ramal 1353

 

Descrição do Sistema:

Fabricante: GE Healthcare Life Sciences

 

O Sistema Biacore T200  possibilita o monitoramento de interações intermoleculares em tempo real sem a necessidade de marcação de um dos ligantes. Amostras em solução são injetadas sobre uma superfície contendo um potencial ligante imobilizado, se a amostra interagir com o ligante imobilizado, o índice de refração na interface entre o sensor da superfície e a solução altera proporcionalmente a massa da superfície. O fenômeno ressonância plasmônica de superfície (SPR) é utilizado para detectar estas alterações em tempo real e os dados são apresentados em gráficos denominados de sensorgramas, perfil da resposta do SPR por tempo. O sensorgrama mostra a associação e dissociação do complexo.

  

 

Principais aplicações:

O Biacore T200 tem sido utilizado no estudo de interações intermoleculares, incluindo receptores, anticorpos, antígenos, enzimas, fatores de crescimento, glicoproteínas, ácidos nucléicos, drogas, membranas, células e vírus. As informações obtidas por análise em SPR são tanto qualitativas (identificação, verificação de especificidade, mapeamento, mapeamento de epítopo, seletividade, entre outros), como quantitativas (em termodinâmica, estudos cinéticos, determinação de afinidade e de concentração).

Resumidamente, o sistema Biacore T200 permite determinar a especificidade, a cinética e a afinidade de interações moleculares e tem sido amplamente utilizado na caracterização molecular, no desenvolvimento e na procura por novos fármacos sem a necessidade da utilização de marcadores no processo.

  

 

 

 II. Plano de gestão

 

A Unidade Multiusuário de Estudos de Interação Molecular por Fluorescência e Ressonância Plasmônica de Superfície fornece ferramentas para a caracterização e estudo de células e proteínas. A unidade não é um laboratório de prestação de serviços, portanto os pesquisadores e usuários tem total responsabilidade na preparação e observação de suas amostras. O usuário que não possui experiência prévia nos equipamentos será acompanhado pelo técnico responsável e treinado até ser capaz de realizar a operação dos mesmos.

 

  1. A Unidade é coordenada pela Profa. Adriana K.  Carmona (Departamento de Biofísica, UNIFESP, Campus Vila Clementino) e Profa. Aparecida S. Tanaka (Departamento de Bioquímica, UNIFESP, Campus Vila Clementino).
  2. Dois técnicos foram treinados para operar os equipamentos e dar  o suporte aos usuários para manter o bom funcionamento da unidade. Estes técnicos são: Thaysa Paschoalin, responsável pelo Sistema de Microscopia de Campo Claro e Fluorescência epelo Espectrofotômetro e Ricardo J.S. Torquato, responsável pelo Sistema de Ressonância Plasmônica de Superfície. Cabe aos técnicos responsáveis verificar os agendamentos e orientar/acompanhar os usuários durante os procedimentos.
  3. Os usuários poderão entrar em contato com os técnicospor meio do site ou e-mail. Após cadastramento, poderá ser agendado o uso dos equipamentos. O usuário deverá mencionar a Unidade de Multiusuário nas publicações.
  4. No caso de publicações em que forem utilizados o microscópio de fluorescência ou o espectrofotômetro, deverá constar na publicação o seguinte número de processo FAPESP 2009/53840-0. No caso de utilização do Biacore, deverá constar o seguinte número de processo FAPESP 2009/53844-6
  5. Os usuários da UNIFESP e de outras instituições serão responsáveis em obter os materiais de consumo necessários para realização dos seus experimentos(chip para os experimentos no Biacore; placas de cultura para as análises no microscópio, placas multiwell ou cubetas para uso nofluorímetro).
  6. O comitê gestor poderá definir futuramente, que os usuários da UNIFESP e de outras instituições sejam cobrados pelo uso dos equipamentos, a fim de garantir o funcionamento da Unidade.   

 

Comitê Gestor:

Profa. Dra. Aparecida Sadae Tanaka - Departamento de Bioquímica - Campus Vila Clementino

Profa. Dra. Adriana Karaoglanovic Carmona – Departamento de Biofísica - Campus Vila Clementino

Prof. Dr. Hélio Kiyoshi Takahashi – Departamento de Bioquímica - Campus Vila Clementino

Prof. Dr. Marcos Leoni Gazarini Dutra - Departamento de Biociências – Campus Baixada Santista

           

 

III. Agendamento

 O agendamento de uso dos equipamentos da Unidade para Estudos de Interações Moleculares por Fluorescência e Ressonância Plasmônica de Superfície poderá ser realizado por meio de e-mail, contato telefônico ou acesso direto à webpage:

 

 1. Microscópio de Fluorescência e Espectrofotômetro

Responsável: Thaysa Paschoalin

E-mail: tpaschoalin@unifesp.br

Telefone: 5576-4450 Ramal 1977

 

 

Acesso ao calendário do Microscópio de Fluorescência: https://www.google.com/calendar/embed?src=20e9u58233e22cm3f8hd603e0k@group.calendar.google.com

 

Acesso ao calendário do Espectrofotômetro: https://www.google.com/calendar/embed?src=855o67h247dpkm8sereiemfoms%40group.calendar.google.com&ctz=America/Sao_Paulo

 

 

 2. Biacore

Responsável: Ricardo J. S. Torquato

E-mail: torquato.bioq@epm.br

Telefone: 5576-4444 Ramal 1353

Webpage: http://www.unifesp.br/centros/multi/web/index.php