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Micrografia eletrônica (colorida) de varredura de célula infectada por uma cepa variante de partículas do vírus Sars-CoV-2, isolada de uma amostra de paciente. Imagem capturada no Centro de Pesquisa Integrada (IRF) do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas (NIAID), em Fort Detrick, Maryland (EUA) / (Imagem: NIAID)
Valquíria Carnaúba
Cientistas no mundo todo debruçam-se sobre o principal mecanismo relacionado à infecção pelo coronavírus. Falamos do sistema renina-angiotensina (SRA), mecanismo hormonal das células envolvido no equilíbrio hidrossalino e na regulação da pressão arterial. A enzima conversora da angiotensina II (ECA2), um dos hormônios desse complexo sistema, é que se liga à proteína spike, que integra a membrana que envolve o patógeno. O principal obstáculo para a obtenção de resultados mais concretos é o pouco que se sabe sobre a ECA2, descoberta há cerca de 20 anos. Cientes da soma de esforços de pesquisadores de diferentes áreas do conhecimento (virologia, fisiopatologia pulmonar e farmacologia celular e molecular), Ureshino e Prado vislumbram novas terapias que possam ser aplicadas imediatamente, a partir do reaproveitamento de fármacos já existentes, nos grupos de alto risco.
Hormônios protetores
Uma das primeiras pesquisas desenvolvidas nessa área na Unifesp foi a de Rodrigo Ureshino, docente do Instituto de Ciências Ambientais, Químicas e Farmacêuticas (ICAQF/Unifesp) - Campus Diadema e integrante do Laboratório de Endocrinologia Molecular e Translacional. Em maio de 2020, ele se uniu a pesquisadores dos campi Diadema, São Paulo e Baixada Santista, bem como da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa. A questão principal levantada por eles moveu outros estudos ao longo daquele ano: o papel da enzima conversora da angiotensina II (ECA2) no contágio pelo Sars-CoV-2 e sua relação com as formas graves da doença.
Há 20 anos a ECA e a ECA2, cuja atividade está relacionada ao sistema renina-angiotensina (SRA), são objeto de estudo no mundo todo. Desde que foi descoberta, pesquisadores de diferentes áreas do conhecimento entenderam que, ao lado da ECA, a proteína ECA2 integra um mecanismo hormonal das células envolvido no equilíbrio hidrossalino e na regulação da pressão arterial. A ECA é a enzima responsável pela conversão da angiotensina I em angiotensina II. A angiotensina II liga-se às paredes dos vasos sanguíneos provocando a vasoconstrição.
Juntar as peças do quebra-cabeça estava ajudando a ciência a compreender melhor o mecanismo de entrada de outros coronavírus humanos, como o HCoV-NL63 e o Sars-CoV. A pandemia provocada pelo Sars-CoV-2, contudo, ampliou a curiosidade sobre esse mecanismo e os estudos a ele direcionados. Nesse contexto, Ureshino tem-se aprofundado no conhecimento sobre a proteção natural que o estrogênio exerce nas mulheres contra a doença; estrogênio é a designação genérica de hormônios envolvidos no controle da ovulação e no desenvolvimento de características femininas (como o estradiol e a estrona).
Rodrigo Ureshino, docente do Instituto de Ciências Ambientais, Químicas e Farmacêuticas (ICAQF/Unifesp) - Campus Diadema
Sua pesquisa, denominada Avaliação de Compostos com Potencial Terapêutico para Sars-CoV-2: Enfoque em Compostos com Atividade Estrogênica, Moduladores da Autofagia e ECA2, é financiada pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (Fapesp). Os dados preliminares, publicados na revista Physiological Reports, mostraram que um desses hormônios, o estradiol ou 17β-estradiol, foi capaz de reduzir em mais de 40% a carga viral de células infectadas pelo coronavírus. O estudo in vitro foi feito com células Vero E6, pertencentes a uma linhagem estabelecida a partir de células renais do macaco-verde africano (Cercopithecus aethiops) e usadas como hospedeiras para o vírus.
Para infectar a célula humana e iniciar a replicação de seu material genético, o coronavírus precisa ancorar-se nela. Isso acontece quando uma proteína da membrana viral, a spike, liga-se à enzima conversora da angiotensina II, que está na membrana da célula atacada. A “entrega” do material genético viral depende da união das membranas do vírus e da célula humana, e isso pode ocorrer por duas rotas: por clivagem (quebra de ligações moleculares) da proteína spike na membrana celular ou por endocitose. No primeiro caso, verifica-se essa quebra por enzimas, como a transmembrane protease serine 2 (TMPRSS2). Quando se trata da endocitose, porém, a quebra das ligações da spike acontece após o vírus ser “engolido” pela célula. A etapa seguinte é a replicação viral – quando o coronavírus começa a produzir novas cópias de si mesmo dentro da célula infectada.
Ainda não se sabe como o estrógeno 17β-estradiol diminui a carga viral. “Há duas hipóteses, por ora. Ou o estrógeno estaria diminuindo a infecção celular, via modulação gênica da TMPRSS2 (que nesse caso iria ‘atrapalhar’ a clivagem da proteína spike, ligada à ECA2), ou estaria interferindo na replicação do material genético do vírus dentro da célula.”
A pesquisa também avalia compostos diversos, como fármacos, que poderiam agir na modulação da autofagia em células humanas, ou seja, na degradação de seus próprios componentes internos. De maneira simplificada, o coronavírus replica seu material genético na célula infectada aproveitando-se da autofagia celular. Por meio desse mecanismo, a célula degrada e reaproveita componentes internos “danosos”, como os patógenos.
Considerando que a autofagia celular é fundamental para a regeneração natural, por reduzir a chance de surgirem algumas doenças, o estudo busca entender como a modulação da autofagia celular poderia frear a multiplicação do vírus sem, contudo, prejudicar as células invadidas. “Talvez, associando esses compostos a outros, encontremos algum benefício no uso deles”, complementa.
Os testes estão sendo feitos em células de linhagem humana no Laboratório de Biossegurança Máxima (NB3) da universidade, coordenado pelo docente Mário Janini, a partir de uma biblioteca de compostos com atividade estrogênica. “O vírus será cultivado em linhagens celulares que possam suportar a replicação viral, dentre elas as células epiteliais brônquicas humanas (BEAS) e as células epiteliais alveolares encontradas no tecido pulmonar (A549)”, finaliza.
O screening virtual é uma triagem por simulação, realizada com o auxílio do programa de imagens Biovia Discovery Studio, que detecta se as moléculas provenientes dos medicamentos testados atuam nos receptores nicotínicos ou na proteína spike do coronavírus
Dos estrógenos aos receptores nicotínicos
Se a pesquisa de Ureshino chegou a dados importantes sobre a ação do 17β-estradiol e a modulação da expressão gênica da protease TMPRSS2, que influenciam a invasão da célula humana, a professora associada do Instituto de Saúde e Sociedade (ISS/Unifesp) - Campus Baixada Santista Carla Máximo Prado verifica como os receptores nicotínicos presentes nas células do epitélio pulmonar influenciam a expressão da ECA2 e todo o processo inflamatório característico da covid-19 no aparelho respiratório.
Será que você pensou em nicotina após ler os termos “receptores nicotínicos”? De fato, estamos falando sobre o mesmo mecanismo fisiológico que leva ao vício do cigarro. Esses receptores, contudo, são ativados pela acetilcolina (ACh), hormônio neurotransmissor produzido pelo sistema nervoso (central e periférico). É ele que estimula os receptores nicotínicos, mediando respostas entre as células nervosas e as periféricas – encontradas na corrente sanguínea. Entre suas tarefas principais, podemos enumerar a vasodilatação, regulação da frequência cardíaca, aumento do suor e, claro, resposta inflamatória pulmonar. A pesquisadora vai além. “No pulmão, a acetilcolina tem um papel antagônico, ou seja, dependendo do receptor com que ela atua, o efeito pode ser inflamatório (receptores muscarínicos) ou anti-inflamatório (receptores nicotínicos)”, esclarece.
Prado possui uma linha de investigação nessa área já há alguns anos, em parceria com pesquisadores da Universidade de Western Ontario, no Canadá, e da Universidade do Texas. “Desde 2010 estudamos a via colinérgica anti-inflamatória, sistema mediado pela ACh e envolvido no controle das respostas imunes por meio do controle dos processos inflamatórios. Os animais geneticamente modificados, usados por nós para estudar doenças pulmonares, apresentaram uma redução do transportador de acetilcolina, condição que leva a quadros de inflamação pulmonar”, explica a docente.
A forma como ela estabeleceu a relação entre ACh, receptores nicotínicos e expressão da ECA2 é o diferencial da pesquisa. O primeiro ponto observado foi que apenas dois trabalhos mostraram que, entre os pacientes internados com quadro grave de covid-19, não havia uma proporção mais alta de fumantes. Começou, então, a questionar se, mesmo com os danos pulmonares causados pelo hábito de fumar, a ativação dos receptores nicotínicos poderia, de certa forma, retardar a piora do quadro de saúde desses pacientes ante as complicações da covid-19.
Outro fator decisivo para a estruturação do projeto de pesquisa foi a confirmação de que o uso de fármacos que ativam os receptores nicotínicos levou à melhora da inflamação nos modelos animais utilizados para o estudo de doenças pulmonares. “Adotamos esse procedimento com os animais asmáticos, nos quais também houve melhora do quadro alérgico. Entre os animais com lesão pulmonar aguda, um quadro que se assemelha muito ao dos pacientes com infecção grave por coronavírus, a resposta também foi positiva”, aponta. “Em ambos os casos, houve uma rápida deterioração do epitélio pulmonar devido à síndrome de liberação de citocinas ou ‘tempestade de citocinas’ (cytokine storm), uma superprodução de células imunes e citocinas, que levam ao rápido comprometimento do órgão.”
Prado acredita que a estimulação desses receptores nicotínicos pode levar à alteração da expressão da ECA2, dificultando a ancoragem do coronavírus nas células. “Como o estudo iniciou-se há pouco tempo, essa relação não está clara. Por isso, vamos estudar culturas celulares do epitélio pulmonar, colocadas em um meio que facilite a invasão por coronavírus em células que superexpressam a ECA2, um modelo desenvolvido por Roberta Sessa Stilhano Yamaguchi, da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa. Se houver alteração da expressão dos receptores nicotínicos e for constatada alguma relação entre a invasão pelo vírus e a ECA2, entenderemos com mais precisão a atividade desses elementos”, pontua a docente.
Se a relação entre ECA2, receptores nicotínicos e infecção indicar a diminuição da entrada de coronavírus nas células, o estudo partirá para a segunda etapa: o screening virtual. A técnica consiste exatamente no que seu nome indica, uma triagem virtual com o auxílio do programa Biovia Discovery Studio, que detecta se as moléculas provenientes dos medicamentos testados atuam nos receptores nicotínicos ou na proteína spike do coronavírus. A ideia é identificar medicamentos potenciais para uso terapêutico.
“Insisti, ao escrever o projeto, sobre a importância da pesquisa, mesmo com a iminência das vacinas. A resposta inflamatória pulmonar que ocorre com a covid-19 evolui para a síndrome do desconforto respiratório agudo; essa inflamação aguda é caracterizada pela ‘tempestade de citocinas’. A síndrome mencionada é também uma resposta do organismo a outras enfermidades, além da covid-19, como a pneumonia, tuberculose, queimaduras e múltiplas fraturas. Até cirurgias que precisam restringir momentaneamente o fluxo de sangue, como as de intestino, podem levar a quadros de inflamação aguda nos pulmões. Atualmente, de 30% a 40% dos pacientes com tal síndrome, internados em UTI, evoluem para óbito. Além disso, a alteração do sistema da angiotensina está envolvida em diversas outras doenças. Entender se a nicotina se relaciona com a ECA2 pode auxiliar no desenvolvimento de outras terapias.”
(Carla Máximo Prado)
